Egzopeptidaza dipeptidil peptidaza III (DPP III) posljednjih je godina privukla pozornost istraživačkih skupina diljem svijeta. Široko je zastupljena u tkivu sisavaca i smatra se da sudjeluje u završnim koracima normalnog intracelularnog katabolizma proteina. Međutim, izraženi afinitet za neke bioaktivne peptide (angiotenzin II i III, te opioidne peptide) sugerira njene specifične funkcije. Također, raste broj eksperimentalnih dokaza koji upućuju na uključenost DPP III u razvoj nekih karcinoma kod ljudi. Ipak, poznavanje njene točne uloge u tim procesima još uvijek nije zadovoljavajuća.

Cilj predloženog istraživanja je unaprijediti znanje o biološkoj važnosti ovog cink-veznog metaloenzima i njegovom utjecaju na ljudsko zdravlje. U tu svrhu planiramo slijedeće aktivnosti: (1) razvoj novih parametara za ion cinka u proteinima i optimizacija računalnih pristupa u proučavanju metaloenzimske strukture, te kombinirana, računalna i eksperimentalna studija ionske izmjene metala kod ljudske DPP III (hDPP III), uključujući identifikaciju potencijalnog inhibitornog veznog mjesta za metal, (2) istraživanje uključenosti hDPP III u signalni put Keap1-Nrf2- kako bi se rasvijetlila njezina uloga u oksidativnom stresu, (3) proširenje saznanja o prirodnim supstratima hDPP III kod čovjeka i (4) ispitivanje novih, moćnih inhibitora katalitičke funkcije hDPP III. U svrhu diseminacije saznanja o važnosti DPP III i unapređenja suradnje s inozemnim znanstvenim institucijama, planiramo predstaviti naše rezultate na međunarodnim konferencijama i organizirati simpozij o DPP III.

Iako je element u tragovima, cink ima značajnu ulogu u ljudskom zdravlju. Poznato je da ima aktivnu ulogu u hidrolizi peptida kataliziranoj hDPP III, ali ništa nije poznato o potencijalnom inhibitornom metalnom veznom mjestu. Također, nije poznat mehanizam izmjene metala u hDPP III. Parametri za cink koje smo koristili u prethodnim simulacijama molekularne dinamike (MD) DPP III ortologa omogućili su nam pouzdano modeliranje enzimske strukture i fleksibilnosti, tj. rezultati simulacija odgovarali su onima dobivenim eksperimentalnim metodama.

Međutim, primijetili smo snažnu preferenciju za oktaedarsku koordinaciju cinka, čak i u najkompaktnijoj strukturi kompleksa enzim-supstrat za koju su izračuni kvantne i molekularne mehanike (QMMM) za mehanizam reakcije sugerirali tetraedarsku koordinaciju Zn2+ kao najpovoljniju za reaktant. Kako bismo osigurali pouzdanost molekulskog modeliranja procesa u kojima je metalni ion u središtu interesa razvit ćemo nove parametre za Zn2+. U tu svrhu koristit ćemo QM i QMMM metode u kombinaciji s MD simulacijama i mikrokalorimetrijom.

Kako bismo utvrdili ulogu DPP III u karcinogenezi, istražit ćemo njenu uključenost u signalni put Keap1-Nrf2 na molekularnoj razini. Kombinacija računalnog (all atom simulacije molekulske dinamike) i eksperimentalnog (kinetički, spektrometrijski, strukturni i termodinamički) pristupa može nam omogućiti napredak u razumijevanju molekularne osnove interakcija hDPP III- Keap1 i njihov utjecaj na stanične procese.

Podaci o visokim koncentracijama DPP III u površinskim lamelama stražnjih rogova kralježnične moždine kod štakora, gdje se taj enzim lokalizira s enkefalinima i endomorfinima, zajedno sa spoznajom da DPP III može degradirati te opioidne peptide in vitro, potvrđuju ulogu DPP III u endogenom sustavu regulacije boli kod sisavaca. U sklopu ovog projekta planiramo ispitati seriju od oko 10 neuropeptida, računalno i eksperimentalno. Identifikacija potencijalnih supstrata među njima bila bi vrijedno otkriće za objašnjenje uloga DPP III kod čovjeka.

Također, istražit će se mogućnost vezanja na hDPP III za niz fluorescentnih gvanidinijevih karbonil-pirol konjugata. Kinetičke, fluorimetrijske i mikrokalorimetrijske studije njihovog vezanja na divlji tip hDPP III i njen katalitički inaktivni mutant E451A bit će kombinirane s MD simulacijama i izračunima slobodne energije vezanja.

Konačno, naša bi istraživanja trebala unaprijediti poznavanje molekularne osnove interakcija protein-protein (DPP III - Keap1) i protein-ligand (DPP III - peptidi /inhibitori), te njihovu povezanost sa staničnim procesima, kao i rasvijetliti biološku ulogu hDPP III. Studija bi trebala predložiti smjernice za razvoj farmakoloških molekula s mogućnošću kontrole mehanizama u kojima sudjeluje hDPP III. Konačno, novo razvijeni parametri za ion cinka bit će korisni ne samo za DPP III, već i za ostale proteine sa sličnim veznim mjestom za cink.