UV zračenje, kemikalije iz okoliša, pa čak i prirodni procesi unutar stanice mogu uzrokovati oštećenje DNA, molekule koja nosi sve informacije potrebne za funkcioniranje života. Stoga, stanice u našem tijelu svakodnevno prolaze kroz niz "popravaka" kako bi osigurale pravilno funkcioniranje. No, što se događa kada ti popravci zakažu?

''Putevi popravka oštećenja DNA ključni su mehanizmi koje stanice koriste za održavanje integriteta svojih genetskih informacija. Ovi mehanizmi pomažu popraviti oštećenja i spriječiti štetne mutacije koje mogu dovesti do pojave tumora, ili do stanične smrti. Stanična smrt je s jedne strane poželjan ishod, jer stanica opterećena mutacijama može izazvati teške bolesti poput raka, dok je s druge strane nepoželjan ishod, ako se radi o neuronima jer može dovesti do bolesti mozga poput demencije ili neurodegenerativnih bolesti'', objašnjava dr. sc. Marta Popović, voditeljica Grupe za DNA popravak u Laboratoriju za molekularnu ekotoksikologiju Zavoda za istraživanje mora i okoliša IRB-a.

Još od 1950-ih godina kada je otkrivena struktura DNA i prvi putevi popravka DNA oštećenja, smatralo se da se popravak DNA uvijek događa na mjestu oštećenja, a to su stanična jezgra i mitohondriji u kojima se DNA nalazi. No, novo istraživanje objavljeno u časopisu Cell pokazuje kako se proces popravka DNA može odvijati izvan jezgre, u citoplazmi, uz pomoć procesa poznatog kao autofagija. To je prirodni proces recikliranja staničnih dijelova, tijekom kojeg se "stanični otpad" šalje u lizosome – organele odgovorne za razgradnju i recikliranje molekula koje više nisu potrebne stanici.

Nukleofagija: Novi put popravka DNA

Istraživanje koje je proveo ovaj multidisciplinarni tim znanstvenika proširuje dosadašnje spoznaje o autofagiji, uvodeći novi proces nazvan nukleofagija. Dok je autofagija već poznata kao proces kojim stanice razgrađuju vlastite oštećene dijelove, nukleofagija specifično uključuje uklanjanje oštećenih dijelova DNA iz jezgre. U ovom procesu, proteini koji su nepovratno kovalentno vezani na DNA ( eng. DNA-protein crosslinks (DPC), uklanjaju se iz jezgre i transportiraju do lizosoma gdje se razgrađuju. Na taj način nukleofagija štiti genetski materijal stanica i doprinosi njihovom preživljavanju.

Multidisciplinarni pristup ovog istraživanja bio je ključan za otkriće nukleofagije, a uključivao je biokemiju, staničnu biologiju, masenu spektrometriju, bioinformatiku, korištenje ribe zebrice kao životinjskog modela i materijale pacijenata oboljelih od raka debelog crijeva.

TEX264: Ključni protein u procesu

Centralni protein u ovom procesu je TEX264. On ima tri uloge: prepoznaje DPC oštećenja i dovodi druge proteine potrebne na popravak na mjesto lezije, zatim pokreće nukleofagiju tako da omogućuje izlazak DNA oštećenja kroz jezgrinu ovojnicu, i naposljetku omogućuje ulazak oštećenja u lizosome tako što stupa u interakciju s LC3 receptorom u membrani lizosoma.  

Ovo otkriće ima ključnu važnost u kontekstu istraživanja tumora, jer neki kemoterapijski lijekovi, kao što je irinotekan, uzrokuju stvaranje DPC oštećenja. TEX264 omogućuje stanicama da uklone ova oštećenja i prežive terapiju, što znači da tumorske stanice mogu uspješno obnoviti svoj genetski materijal i tako nastaviti rasti.

Idući korak je razvoj lijekova koji bi mogli blokirati TEX264 i spriječiti tumorske stanice u popravljanju oštećenja. Kombiniranjem inhibicije TEX264 proteina s postojećim lijekovima, poput irinotekana, mogli bi dodatno oslabiti tumorske stanice i poboljšati učinkovitost kemoterapije. Ova strategija mogla bi donijeti značajna poboljšanja u liječenju raka debelog crijeva i drugih tumora.

Mikroinjektiranje proba za utišavanje gena TEX264 u zigotu zebrice i praćenje efekta utišavanja tijekom tri dana razvoja embrija kada se analiziraju razine DNA oštećenja u stanicama.

Zebrice: Modelni organizam za istraživanja

Kako bi istražili funkciju nukleofagije i proteina TEX264 na razini organizma, znanstvenici su koristili zebricu (Danio rerio), malenu ribu čiji je genom vrlo sličan ljudskom. Zebrice su idealni model za biomedicinska istraživanja jer omogućuju jednostavno praćenje staničnih procesa u stvarnom vremenu. Njihova vanjska oplodnja i razvoj embrija omogućuju lakše proučavanje staničnih mehanizama, dok genetske manipulacije pomoću CRISPR-Cas sustava omogućuju istraživačima relativno brzo i precizno modificiranje gena.

Tim s Ruđera, dr. sc. Cecile Otten i dr. sc. Ivan Antičević pod voditeljstvom dr. sc. Marte Popović iz Grupe za DNA popravak u Laboratoriju za molekularnu ekotoksikologiju Zavoda za istraživanje mora i okoliša pokazao je da utišavanje gena TEX264 uzrokuje akumulaciju DNA oštećenja u embrijima zebrice.  Znanstvenici su također otkrili da, nakon ponovne aktivacije TEX264, DNA normalno započinje popravak. Nasuprot tome, ako u embrijima zebrice aktiviraju TEX264 protein koji nosi mutaciju u domeni LIR, odgovornom za izlazak oštećenja iz jezgre i njihov ulazak u lizosom, popravak je onemogućen, što pokazuje da je ovaj protein ključan upravo za proces nukelofagije.

Važnost za buduće terapije

Nakon eksperimenata na zebrici, kada je postalo jasno da je popravak DNA pomoću TEX264 proteina u procesu nukleofagije bitan i na razini organizma, grupa dr. sc. Kristijana Ramadana sa Sveučilišta u Oxfordu istražila je da li procesi autofagije direktno popravljaju oštećenu DNA nakon kemoterapije. Analize tumora debelog crijeva na 300-tinjak pacijenata koji su primali standardne terapije pokazale su da na osnovu količine TEX264 proteina u stanicama raka debelog crijeva možemo predvidjeti kako će pacijenti odgovoriti na terapiju i produžiti efikasnost standardne terapije.

Ovi rezultati otvaraju vrata razvoju novih lijekova koji ciljano djeluju na proces nukleofagije i TEX264 protein, omogućujući učinkovitije liječenje tumora. Korištenje zebrice kao modela u istraživanjima dodatno naglašava važnost ove ribe u biomedicinskim istraživanjima zbog njezine genetske sličnosti s ljudima i jednostavnosti za laboratorijske eksperimente.

Zebrice na IRB-u

Upravo s ciljem proučavanja ljudskih bolesti i toksikoloških procesa, Laboratorij za molekularnu ekotoksikologiju pri Zavodu za istraživanje mora Instituta Ruđer Bošković uspostavio je pogon za zebrice. Istraživačke grupe pod vodstvom dr. sc. Tvrtka Smitala i dr. sc. Marte Popović razvile su postupke izmjene genoma pomoću CRISPR-Cas tehnologije te razvijaju nove sojeve zebrica za biomedicinska i toksikološka istraživanja.

Za razliku od miševa i štakora, zebrice pružaju brojne prednosti: vanjska oplodnja i razvoj omogućuju praćenje pod mikroskopom, dok veći broj jajašaca po leglu osigurava statistički značajnije rezultate. Osim toga, njihovo održavanje je jednostavnije i jeftinije. Zebrice dijele 99 %  gena uključenih u popravak DNA s ljudima, dok 84 % ljudskih gena povezanih s bolestima imaju svoje ekvivalente kod zebrica, što ih čini izvrsnim modelom za istraživanja raka, neurodegenerativnih, kardiovaskularnih i metaboličkih bolesti.

Također bitno, zamjena modela glodavaca zebricama u skladu je sa smjernicama EU komisije za korištenje životinjskih modela u znanstvenim istraživanjima i slijedi načelo 3R: Reduce, Replace, Refine.