U radu koji je objavljen u srpnju 2023. znanstvenici su opisali novu metodu za analizu RNA u stanicama uz pomoću metode PCR-a (lančane reakcije polimerazom) bez prethodnog odstranjivanja DNA kontaminanata. Ova nova metoda omogućuje preciznije mjerenje koncentracije RNA i pruža jasniji uvid u genetske procese i biološke mehanizme. Osim toga, olakšava proučavanje ponavljajućih gena, što ima širok spektar primjena u biološkim istraživanjima.

Tradicionalno, analiza RNA slična je dešifriranju šapata u bučnoj, prepunoj sobi, pri čemu kontaminacija DNA "muti jasnoću rezultata." U svijetu molekularne biologije, taj šapat predstavljaju poruke molekula RNA, čiji je zadatak prenositi genetske upute za izgradnju proteina, dok buka predstavlja molekulu DNA, koja može ometati i zamagliti rezultate.

Da bi "pojačali" šapat RNA i učinili ga razumljivim unatoč buci, znanstvenici koriste metodu poznatu kao PCR. No, prije nego što započnu s dešifriranjem, moraju se nositi s izazovom uklanjanja "buke" koju uzrokuje DNA.  RNA se u procesu umnažanja najprije prevodi u stabilniju formu, u komplementarnu DNA (cDNA) pomoću enzima reverzne transkriptaze. Međutim, nemoguće je razlikovati cDNA od kontaminacije DNA, a kako tretmani za uklanjanje DNA nisu 100% učinkoviti dolazi do lažno pozitivnih rezultata. Upravo tu nastupa nova metoda koju su znanstvenici opisali u radu: "Reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) without the need for prior removal of DNA".

Ova nova metoda omogućava analizu RNA bez prethodnog odstranjivanja kontaminacije DNA. Korištenjem posebno dizajniranih genetskih "primera" koji se savršeno poklapaju samo s cDNA. Nova metoda izravno cilja RNA poruke, čime se eliminira potreba za složenim koracima pročišćavanja.

Slika 1. Princip nove metode za kvantifikaciju transkriptoma

''U usporedbi s postojećim metodama, ova metoda je preciznija, jednostavnija i reproducibilnija jer čuva integritet RNA, ne zahtijeva reagense koji se koriste za eliminaciju DNA, te također smanjuje broj uzoraka koje treba koristiti kao negativne kontrole. Metoda uključuje upotrebu specifično modificirane klice tijekom reverzne transkripcije koja sadrži pojedinačne nekomplementarne baze, čime se dobivaju cDNA molekule koje se razlikuju od genomske DNA. Naime, modificirana klica, djelomično komplementarna ciljnoj sekvenci, hibridizira na temperaturama od 37-42 °C koje se koriste tijekom koraka reverzne transkripcije. U idućem koraku umnažanja PCR-om, nakon što radna temperatura dosegne oko 60 °C, modificirana klica prepoznaje specifično cDNA, ali ne genomsku DNA'', objašnjava dr. sc. Đurđica Ugarković, dopisna autorica na radu.

''Metoda je posebno prikladna za kvantifikaciju transkripata visoko ponavljajućih DNA, kao što je satelitska DNA kao i za kvantifikaciju ekspresije bakterijskih i virusnih gena'', naglašava dr. Damir Đermić prvi autor na ovom radu.

Autori također ističu neosjetljivost metode na kontaminaciju DNA koja obično dovodi do lažno pozitivnih signala. Štoviše, preskakanje koraka eliminacije DNA učinkovito čuva RNA od razgradnje te se na taj način izbjegavaju dva glavna izvora inherentne netočnosti u analizama transkriptoma.

Istraživanje je financirano u sklopu projekta HRZZ-a IP-2019-04-6915 (voditelj dr. sc. Ð. Ugarković) i IP-2019-04-3790 (voditelj dr. sc. D. Đermić), kao i sredstvima talijanskog Ministarstva obrazovanja, sveučilišta i istraživanja (MIUR), FFABR2017, fonda za ulaganja u osnovna istraživanja (FIRB), odnosno Programa mobilnosti međunarodnog osoblja Sveučilišta u Napulju Federico II dodijeljenih dr. sc.  I. Feliciellu.