Ukratko o temi istraživanja

Radi se o članku pod nazivom „Molecular characterization of zebrafish Oatp1d1 (Slco1d1), a novel Organic anion-transporting polypeptide“ (doi: 10.1074/jbc.M113.518506) u kojem je opisano otkriće i funkcionalna karakterizacija jednog novog membranskog proteina viših kralješnjaka. U istraživanju je kao model korištena riba zebrica (Danio rerio), kao široko zastupljen i sve važniji modelni organizam u biomedicinskim i (eko)toksikološkim istraživanjima, a temeljni cilj istraživanja bio je odrediti funkciju ovog novootkrivenog proteina i evolucijski ga povezati sa sličnim proteinima sisavaca i drugih kralješnjaka.

Najvažniji rezultati

Filogenetska analiza genoma predstavnika kralješnjaka, počevši od najprimitivnijih urochordata (Ciona intestinalis), preko riba koštunjača (zebrica, medaka), vodozemaca (žaba Xenopus tropicalis), gmazova (Anolis carolinensis), ptica (kokoš Gallus gallus i prepelica Coturnix japonica ) i sisavaca (miš, štakor, čovjek), pokazala je da se proteinska podobitelj Oatp1d tijekom evolucije kralješnjaka javlja kod riba koštunjača, te zatim nestaje kod vodozemaca i viših kralješnjaka. Prema tome, predstavnik obitelji Oatp1d1 nema izravne ortologe kod viših kralješnjaka. Stoga je idući cilj istraživanja bio otkriti funkciju ovog membranskog proteina, te razjasniti kojem od predstavnika Oatp1 obitelji sisavaca je najsličniji.

Prvo je ekspresijskom analizom utvrđeno da je Oatp1d1 prisutan u svim tkivima zebrice, ali da se u najvećoj količini javlja u jetri, mozgu i testisima. Visoka ekspresija membranskog proteina u mozgu i gonadama ukazivala je na to da Oatp1d1 prenosi određene fiziološki bitne molekule, dok je ekspresija u jetri kao glavnom organu za metabolizaciju i ekskreciju toksikanata ukazivala na potencijalnu ulogu Oatp1d1 u prijenosu ksenobiotika (stanici stranih tvari koji uključuju npr. lijekove i okolišna zagađivala). Provedena je funkcionalna analiza proteina kojom je ustanovljeno da Oatp1d1 prenosi konjugate steroidnih hormona (estrogena i testosterona) i kortizol, dok ga nativni steroidni hormoni estradiol i testosteron blokiraju. Na temelju ovih rezultata predložena je važna uloga Oatp1d1 transportnog proteina u održavanju hormonalne ravnoteže u riba. Usporedbom supstrata i inhibitora Oatp1d1 (njih 40-ak), sa supstratima i inibitorima srodnih proteina u ljudi i glodavaca, ustanovljeno je da je Oatp1d1 funkcionalni ortolog čak tri ljudska OATP proteina: OATP1A2, OATP1B1 i OATP1B3. Važan zaključak ovih spoznaja jest i da je uloga OATP transportera u steroidnom katabolizmu evolucijski sačuvana od riba do čovjeka.

Nakon filogenetske, ekspresijske i funkcionalne analize slijedila je i strukturna analiza proteina, kojom je otkriveno više evolucijski i funkcionalno važnih strukturnih značajki:

1. Glikozilacija Oatp1d1 je signal za pravilnu lokalizaciju transportera u staničnoj membrani te su identificirane aminokiseline odgovorne za ovu posttranslacijsku modifikaciju (Asn 122, 133, 499 i 512). Ove aminokiseline prisutne su kod svih OATP1 proteina od riba do čovjeka;
2. Specifični konzervirani motiv za vezanje kolesterola (CRAC), ustanovljen kod Oatp1d1 zebrice, prisutan je kod svih OATP transportera kralješnjaka i njegova mutacija vodi do nepravilne membranske lokalizacije Oatp1d1, vjerojatno kroz interakciju s membranskim kolesterolom;
3. Oatp1d1 je u membrani prisutan u oligomernom obliku (četiri ili više proteina tvore kompleks) preko interakcije glikoforinskih motiva u transmembranskim domenama (TMD) 5. i 8., a ovi motivi također su konzervirani unutar OATP1 obitelji kralješnjaka (Slika 1).

Slika 1. Analiza fluorescencijskim mikroskopom pokazuje da se Oatp1d1 ne lokalizira u staničnoj membrani (slika lijevo), ako nije u dimernoj formi (slika desno). Membrane su obojene crveno, a protein nosi zelenu boju. Na desnoj slici vidi se kolokalizacija proteina (zeleno) sa staničnom membranom (crveno), te njihovo preklapanje daje narančastu boju. 

Naposljetku je napravljena analiza transportnog mehanizma Oatp1d1, kojom je ustanovljeno da je ovaj transportni protein ovisan o pH gradijentu, te se njegova aktivnost mijenja ovisno u unutarstaničnom i izvanstaničnom pH. Ovisnost o pH gradijentu indikacija je transportnog mehanizma koji vjerojatno uključuje antiport s bikarbonatnim ionima. To bi značilo da Oatp1d1 ubacuje jednu molekulu supstrata u stanicu u zamjenu za jedan ili više bikarbonatnih iona koje istovremeno izbacuje iz stanice. Ovaj mehanizam zabilježen je kod tri OATP1 transportera ljudi, te ovi rezultati jasno ukazuju na evolucijsku sačuvanost transportnog mehanizma OATP proteina kralješnjaka.