Znanstvenici IRB-a razvili metodu za neciljano metaboličko profiliranje bioloških uzoraka
Multidisciplinarni tim znanstvenika Instituta Ruđer Bošković, dr. Ivica Kopriva iz Zavoda za elektroniku, dr. Ivanka Jerić iz Zavoda za organsku kemiju i biokemiju, dr. Marijana Popović Hadžija i dr. Mirko Hadžija iz Zavoda za molekularnu medicinu, te dr. Marijana Vučić Lovrenčić iz Kliničkog zavoda za medicinsku biokemiju i laboratorijsku medicinu Kliničke Bolnice Merkur, razvili su metodu za neciljano metaboličko profiliranje bioloških uzoraka.
Razvijena metoda rezultat je istraživanja u okviru projekta Hrvatske zaklade za znanost IP-2016-06-5235 voditelja dr.sc. Ivice Koprive. Rezultat je objavljen u znanstvenom časopisu Analytical Chemistry. Faktor odjeka časopisa je 6.785, što ga svrstava u vodećih 8% (7/86) u području analitičke kemije.
Metabolomika podrazumijeva identifikaciju i kvantifikaciju malih organskih molekula, poznatih kao metaboliti ili čiste komponente, prisutnih u kompleksnim biološkim uzorcima, s naglaskom na metabolite koji diskriminiraju patološka od zdravih stanja.
Zbog kvantitativnog karaktera, vremenske učinkovitosti i robusnosti, spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije jezgri vodika (1H NMR spektroskopija) se koristi ekstenzivno u metaboličkom profiliranju bioloških uzoraka, kao što su plazma, urin ili cerebrospinalna tekućina. No uzak frekvencijski pojas 1H NMR spektroskopije uzrokuje preklapanje rezonantnih frekvencija metabolita prisutnih u uzorku.
Stoga točna identifikacija metabolita predstavlja veliki izazov za kemometrijske metode. Koncentracija pojedinačnog metabolita proporcionalna je površini ispod amplitudnog spektra NMR signala, stoga se mnoge metode za detekciju i identifikaciju metabolita temelje na uklapanju zbroja spektara metabolita u NMR spektar uzorka (engl. fitting). Takav pristup podrazumijeva da je amplitudni NMR spektar uzorka zbroj amplitudnih NMR spektara metabolita.
To je, međutim, točno samo kada se spektri komponenata ne preklapaju. U slučaju 1H NMR spektroskopije to vrijedi samo u određenim spektralnim prozorima gdje je prisutan mali broj metabolita. Zbog toga se opisani pristup koristi, na primjer, u ciljanom metaboličkom profiliranju cerebrospinalne tekućine, ali se ne preferira u neciljanom metaboličkom profiliranju urina ili krvi.
U objavljenom radu, autori su predložili primjenu metode nenegativnih najmanjih kvadrata (NNK) za procjenu udjela metabolita prisutnih u 1H NMR spektru uzorka. Time je adresiran problem neciljanog metaboličkog profiliranja bioloških uzoraka. Zbog linearnosti 1H NMR spektroskopije i inherentne nenegativnosti udjela metabolita, linearni NNK model je egzaktan. NNK pristup je dodatno motiviran činjenicom da identifikacija metabolita zahtjeva prethodno znanje o metabolitima očekivano prisutnim u uzorku.
Temeljem toga nužno je pretpostaviti da su metaboliti prisutni u uzorku također sadržani u biblioteci čistih komponenata, koja u NNK problemu predstavlja matricu sustava. S tim u vezi, tijekom trajanja projekta snimljena je biblioteka koju čine 1H NMR spektri 210 čistih komponenata, od kojih je približno 110 može naći u urinu. Zbog nenegativnosti udjela, dozvoljene su samo aditivne kombinacije čistih komponenata pri modeliranju spektara biološkog uzorka. To je jako ograničenje koje praktično eliminira selekciju metabolita iz biblioteke koji nisu prisutni u uzorku. Koncept je ilustriran slikom ispod.
Detekcija i identifikacija metabolita. Udjeli metabolita koji se nalaze u 1H NMR spektru biološkog uzorka (urin u provedenoj studiji) procjenjuju se metodom nenegativnih najmanjih kvadrata. Ključnu ulogu ima biblioteka sa 1H NMR spektrima čistih metabolita (matrica sustava u problemu nenegativnih najmanjih kvadrata).
Predložena metoda je identificirala 63 metabolita u uzorcima osoba sa DT2 koji su statistički značajno diskriminirali DT2 skupinu od kontrolne skupine. Od 63 identificirana metabolita njih 14 je potvrđeno u prethodno publiciranim studijama, dok su tri metabolita potvrđena nezavisnom HPLC-MS analizom urina osoba sa DT2. Predložena metoda je također identificirala 46 metabolita u kontrolnim uzorcima koji su prema istoj metodologiji sa statističkom značajnošću diskriminirali kontrolnu skupinu u odnosu DT2 skupinu.
Iz prethodnog opisa je jasno da sadržaj biblioteke metabolita ima ključnu ulogu u detekciji i identifikaciji metabolita u biološkim uzorcima. Trenutno opisana biblioteka omogućila je dokazivanje koncepta neciljanog metaboličkog profiliranja uzoraka humanog urina. No, za potencijalnu kliničku primjenu potrebno je izgraditi biblioteku koja sadrži 1H NMR spektre 458 metabolita, koji su projektom humanog metaboloma identificirani u urinu. Linearan model 1H NMR spektra biološkog uzorka je temelj NNK metode za procjenu udjela metabolita. Taj model podrazumijeva da su spektri metabolita i spektri bioloških uzoraka snimljeni pod istim uvjetima.
U tom smislu posebno je kritična jakost magnetskog polja. Ako se 1H NMR spektri istog metabolita snime na spektrometrima s različitom jakošću magnetskog polja, imati će drugačiji "splitting" (J-couplings), različite širine spektralnih linija i različite rezonantne frekvencije. Da bi se navedeni problemi izbjegli, u objavljenom radu su spektri metabolita i spektri uzoraka urina snimljeni na istom 1H NMR spektrometru.
To, međutim, predstavlja značajnu prepreku kliničkoj primjeni razvijene metode neciljanog metaboličkog profiliranja. U tom je smislu možebitna korekcija spektara snimljenih pri različitim jakostima magnetskog polja važan istraživački problem.