Egzopeptidaza dipeptidil peptidaza III (DPP III) posljednjih je godina privukla pozornost istraživačkih skupina diljem svijeta. Široko je zastupljena u tkivu sisavaca i smatra se da sudjeluje u završnim koracima normalnog intracelularnog katabolizma proteina. Međutim, izraženi afinitet za neke bioaktivne peptide (angiotenzin II i III, te opioidne peptide) sugerira njene specifične funkcije. Također, raste broj eksperimentalnih dokaza koji upućuju na uključenost DPP III u razvoj nekih karcinoma kod ljudi. Ipak, poznavanje njene točne uloge u tim procesima još uvijek nije zadovoljavajuća.

Cilj predloženog istraživanja je unaprijediti znanje o biološkoj važnosti ovog cink-veznog metaloenzima i njegovom utjecaju na ljudsko zdravlje. U tu svrhu planiramo slijedeće aktivnosti: (1) razvoj novih parametara za ion cinka u proteinima i optimizacija računalnih pristupa u proučavanju metaloenzimske strukture, te kombinirana, računalna i eksperimentalna studija ionske izmjene metala kod ljudske DPP III (hDPP III), uključujući identifikaciju potencijalnog inhibitornog veznog mjesta za metal, (2) istraživanje uključenosti hDPP III u signalni put Keap1-Nrf2- kako bi se rasvijetlila njezina uloga u oksidativnom stresu, (3) proširenje saznanja o prirodnim supstratima hDPP III kod čovjeka i (4) ispitivanje novih, moćnih inhibitora katalitičke funkcije hDPP III. U svrhu diseminacije saznanja o važnosti DPP III i unapređenja suradnje s inozemnim znanstvenim institucijama, planiramo predstaviti naše rezultate na međunarodnim konferencijama i organizirati simpozij o DPP III.

Iako je element u tragovima, cink ima značajnu ulogu u ljudskom zdravlju. Poznato je da ima aktivnu ulogu u hidrolizi peptida kataliziranoj hDPP III, ali ništa nije poznato o potencijalnom inhibitornom metalnom veznom mjestu. Također, nije poznat mehanizam izmjene metala u hDPP III. Parametri za cink koje smo koristili u prethodnim simulacijama molekularne dinamike (MD) DPP III ortologa omogućili su nam pouzdano modeliranje enzimske strukture i fleksibilnosti, tj. rezultati simulacija odgovarali su onima dobivenim eksperimentalnim metodama.

Međutim, primijetili smo snažnu preferenciju za oktaedarsku koordinaciju cinka, čak i u najkompaktnijoj strukturi kompleksa enzim-supstrat za koju su izračuni kvantne i molekularne mehanike (QMMM) za mehanizam reakcije sugerirali tetraedarsku koordinaciju Zn2+ kao najpovoljniju za reaktant. Kako bismo osigurali pouzdanost molekulskog modeliranja procesa u kojima je metalni ion u središtu interesa razvit ćemo nove parametre za Zn2+. U tu svrhu koristit ćemo QM i QMMM metode u kombinaciji s MD simulacijama i mikrokalorimetrijom.

Kako bismo utvrdili ulogu DPP III u karcinogenezi, istražit ćemo njenu uključenost u signalni put Keap1-Nrf2 na molekularnoj razini. Kombinacija računalnog (all atom simulacije molekulske dinamike) i eksperimentalnog (kinetički, spektrometrijski, strukturni i termodinamički) pristupa može nam omogućiti napredak u razumijevanju molekularne osnove interakcija hDPP III- Keap1 i njihov utjecaj na stanične procese.

Podaci o visokim koncentracijama DPP III u površinskim lamelama stražnjih rogova kralježnične moždine kod štakora, gdje se taj enzim lokalizira s enkefalinima i endomorfinima, zajedno sa spoznajom da DPP III može degradirati te opioidne peptide in vitro, potvrđuju ulogu DPP III u endogenom sustavu regulacije boli kod sisavaca. U sklopu ovog projekta planiramo ispitati seriju od oko 10 neuropeptida, računalno i eksperimentalno. Identifikacija potencijalnih supstrata među njima bila bi vrijedno otkriće za objašnjenje uloga DPP III kod čovjeka.

Također, istražit će se mogućnost vezanja na hDPP III za niz fluorescentnih gvanidinijevih karbonil-pirol konjugata. Kinetičke, fluorimetrijske i mikrokalorimetrijske studije njihovog vezanja na divlji tip hDPP III i njen katalitički inaktivni mutant E451A bit će kombinirane s MD simulacijama i izračunima slobodne energije vezanja.

Konačno, naša bi istraživanja trebala unaprijediti poznavanje molekularne osnove interakcija protein-protein (DPP III - Keap1) i protein-ligand (DPP III - peptidi /inhibitori), te njihovu povezanost sa staničnim procesima, kao i rasvijetliti biološku ulogu hDPP III. Studija bi trebala predložiti smjernice za razvoj farmakoloških molekula s mogućnošću kontrole mehanizama u kojima sudjeluje hDPP III. Konačno, novo razvijeni parametri za ion cinka bit će korisni ne samo za DPP III, već i za ostale proteine sa sličnim veznim mjestom za cink.

Publikacije na projektu

1. Ćehić M., Suć Sajko J., Karačić Z., Piotrowski P., Šmidlehner T., Jerić I., Schmuck C., Piantanida I.*, Tomić S.* The guanidiniocarbonylpyrrole - fluorophore conjugates as theragnostic tools for DPP III monitoring and inhibition, J. Biomol. Stru. Dyn (2019)
2. Tomić A., Horvat G., Ramek M., Agić D., Brkić H., Tomić S.* New zinc ion parameters suitable for classical MD simulations of zinc metallo-peptidases. Journal of Chemical Information and Modeling (2019)
3. Matić S., Kekez I., Tomin M., Bogár F., Šupljika F., Kazazić S., Hanić M., Jha S., Brkić H., Bourgeois B., Madl T., Gruber K., Macheroux P., Matković-Čalogović D., Matovina M.*, Tomić S.* Binding of dipeptidyl peptidase III to the oxidative stress cell sensor Kelch-like ECH-associated protein 1 is a two-step process. J. Biomol. Stru. Dyn (2020)
4. Agić D.*, Karnaš M., Šubarić D., Lončarić M., Tomić S., Karačić Z., Bešlo D., Rastija V., Molnar M., Popović B.M., Lisjak M. Coumarin derivatives act as novel inhibitors of human dipeptidyl peptidase III: combined in vitro and in silico study. Pharmaceuticals (2021)
5. Tomić A.*, Tomić S.* Demystifying DPP III Catalyzed Peptide Hydrolysis—Computational Study of the Complete Catalytic Cycle of Human DPP III Catalyzed Tynorphin Hydrolysis. Int. J. Mol. Sci. (2022)
6. Tomić A., Brkić H., Matić A., Tomić S.* Unravelling the inhibitory zinc ion binding site and the metal exchange mechanism in human DPP III. Physical Chemistry Chemical Physics (2021)
7. Ban, Z., Karačić, Z., Tomić, S.*, Amini., H Marder, T.B. & Piantanida, I.* Triarylborane Dyes as a Novel Non-Covalent and Non-Inhibitive Fluorimetric Markers for DPP III Enzyme. Molecules (2021)
8. Matić, S., Tomašić Paić, A., Sobočanec, S., Pinterić, M., Pipalović, G., Martinčić, M., Matovina, M.*, Tomić, S.* Interdisciplinary study of the effects of dipeptidyl-peptidase III cancer mutations on the KEAP1-NRF2 signaling pathway.  International journal of molecular sciences (2022)
9. Karačić, Z., Šupljika, F., Tomić, A., Brkljačić, L., Tomašić Paić, A., Ćehić, M., Tomić, S.* Neuropeptides, substrates and inhibitors of human dipeptidyl peptides III, experimental and computational study - a new substrate identified. International Journal of Biological Macromolecules (2022)
10. Abramić, M.*, Agić, D. Survey of Dipeptidyl Peptidase III Inhibitors: From Small Molecules of Microbial or Synthetic Origin to Aprotinin. Molecules (2022)
11. Agić D.*, Karnaš M., Tomić S., Komar M., Karačić Z., Rastija V., Bešlo D., Šubarić D., Molnar M., Experimental and computational evaluation of dipeptidyl peptidase III inhibitors based on quinazolinone-Schiff's bases. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics (2022)

 Sudjelovanje na skupovima

• 26. hrvatski skup kemičara i kemijskih inženjera, 09.–12.04.2019., Šibenik, pozvano predavanje
• Computational Chemistry Day 2019, 11.05.2019., Farmaceutsko-biokemijskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu, pozvano predavanje
• Math/Chem/Comp 2020,  08.-12.06.2019., Dubrovnik, pozvano predavanje
• 11th Joint Meeting on Medicinal Chemistry, 27.-30.06.2019, Prag, pozvano predavanje
• FEBS INSTRUCT MOBIEU Practical course: Hydrodynamic and thermodynamic analysis of biological macromolecules and their interactions, 26.-31.01.2020, Grenoble, Francuska, Sara Matić Postersko priopćenje
• Simpozij studenata doktorskih studija PMF-a 2020., 28.02.2020., Zagreb, Sara Matić usmeno priopćenje, Antonia Matić postersko priopćenje
• 18. Ružičkini dani, Danas znanost - sutra industrija, 16.-18.09.2020. Vukovar, Antonia Matić postersko priopćenje, Zrinka Karačić postersko priopćenje
• Math/Chem/Comp 2021, 07.-11.06.2021., Dubrovnik, Sanja Tomić usmeno priopćenje, Antonija Tomić postersko priopćenje
• ICGEB Course “Flow cytometry: from basic principles to advanced applications-CytoFlow@ICGEB” – ONLINE EVENT “, 28.-30.09.2021. Trst, Italija i online, Ana Tomašić Paić postersko priopćenje
• 27. Hrvatski skup kemičara i  kemijskih inženjera, 05.-08.10.2021. Veli Lošinj, Sara Matić prezentacija, Antonia Matić postersko priopćenje, Zrinka Karačić postersko priopćenje
• COST Action CA20121 - Bench to bedside transition for pharmacological regulation of NRF2 in noncommunicable diseases, 10.-11.01.2022., online, Mihaela Matovina prezentacija
• Math/Chem/Comp 2022 – 33rd MC2 Conference, 06.-10.06.2022. Dubrovnik, Antonija Tomić predavanje
• 1st Central and Eastern European Conference on Physical Chemistry and Materials Science (CEEC-PCMS1), 26.-30.07.2022. Split, Antonija Tomić postersko priopćenje
• 3rd Molecules Medicinal Chemistry Symposium—Shaping Medicinal Chemistry for the New Decade (MMCS2022), 26.-31.7.2022., Rim, Italija, Sanja Tomić postersko priopćenje
• Regional Biophysics Conference (RBC 2022), 22.-26.8.2022. Pečuh, Mađarska, Sanja Tomić pozvano predavanje
• International Congress of the Croatian Society of Biochemistry and Molecular Biology, HDBMB22: FROM SCIENCE TO KNOWLEDGE, 28.9.-1.10.2022., Brela, Filip Šupljika postersko priopćenje, Antonia Matić postersko priopćenje

Suradnici

Filip Šupljika
Dejan Agić
Hrvoje Brkić
Karl Gruber

Ivana Kekez