Razjašnjavanje fizioloških uloga ljudske dipeptidil peptidaze III
Proteolitički enzimi (peptidaze) sudjeluju u regulaciji velikog broja ključnih procesa u stanici specifičnim cijepanjem odabranih ciljnih proteina. Iako su strukturno i biokemijski detaljno okarakterizirane, za mnoge peptidaze još uvijek nedostaju podaci o njihovim specifičnim supstratima i fiziološkoj ulozi.
Dipeptidil peptidaza III (DPP III) je citoplazmatska metalopeptidaza detaljno okarakterizirana na strukturnoj i enzimatskoj razini, ali njezina fiziološka uloga još je gotovo potpuno nepoznata. Aktivnost DPP III peptidaze prema četiri do deset aminokiselina dugim peptidima sugerira njenu ulogu u završnim fazama razgradnje proteina, dok njezina aktivnost i afinitet prema nekim biološki aktivnim peptidima upućuje na njenu ulogu u regulaciji boli, krvnog tlaka i upali.
Nadalje, uključenost DPP III u odgovor na oksidativni stres putem interakcije s proteinom Keap1 detaljno je opisana, međutim niti jedna od predloženih funkcija proteina DPP III još nije dokazana, a također postoje indikacije da bi mogao imati ulogu i u drugim fiziološkim procesima u stanici. Predložena funkcija u signalnom putu Nrf2/Keap1, kao i česta prekomjerna ekspresija proteina DPP III u različitim tipovima tumora, sugeriraju da bi mogao biti korišten kao tumorski biljeg ili čak meta antitumorske terapije.
Cilj ovog projekta je određivanje fiziološke uloge i važnosti proteina DPP III u bolesti određivanjem njegovih interakcijskih proteina pomoću različitih molekularno-bioloških metoda. U radu ćemo koristiti tzv. metodu "yeast two-hybrid" (Y2H) za identifikaciju novih interakcijskih partnera proteina DPP III, kao i masenu spektrometriju (MS), za identifikaciju proteinskih kompleksa koji uključuju DPP III. Namjeravamo potvrditi interakcijske partnere proteina DPP III dobivene metodom Y2H i MS korištenjem nekoliko dodatnih metoda.
Potvrđeni interakcijski partneri pomoći će nam u identifikaciji signalnih puteva koji uključuju DPP III. Također ćemo testirati da li su novoidentificirani interakcijski partneri proteina DPP III i njegovi supstrati. Osim dobivanja uvida u fiziologiju proteina DPP III, ovaj projekt omogućit će prijenos tehnologije i znanja u Institut Ruđer Bošković, što će pozitivno utjecati na naš budući znanstveni rad, kao i predstavljati prvi korak u osiguravanju trajne financijske potpore istraživanja iz europskih fondova.
Voditeljica projekta
Dr. sc. Koraljka Husnjak
Institute of Biochemistry II, Goethe University School of Medicine, Frankfurt, Njemačka
Suvoditeljica projekta
Suradnici na projektu
- Dr. sc. Marija Abramić, IRB, LBPMM
- Zrinka Karačić, mag. chem., IRB, LBPMM
- Dr. sc. Ana Tomašić Paić, IRB, LBPMM
- Dr. sc. Snježana Jurić, IRB, LBPMM
- Dr. sc. Akmaral Kussayeva, LBPMM, IRB
- Sara Matić, mag. mol. biol., LBPMM, IRB
- Dr. sc. Iva Pavlović, IRB, LBPMM
Aktivnosti na projektu
Mihaela Matovina je od 2.- 22.10.2016. bila u posjetu Laboratoriju dr. sc. Koraljke Husnjak na Institutu za biokemiju II, Medicinskog fakulteta Goethe Sveučilišta u Frankfurtu i radila pokuse tzv. Dvostrukog hibridnog sustava kvasca (eng. Yeast-two-hybrid system, Y2H) za određivanje interakcijskih partnera proteina DPP III na razini cijelog ljudskog proteoma.
Zrinka Karačić, Ana Tomašić Paić i Mihaela Matovina su 10.2.2017. sudjelovale na 3. minisimpoziju o DPP III u Grazu, Austrija. Mihaela Matovina je imala poster pod naslovom „Metodologija analize DPP III interaktoma“.
Koraljka Husnjak bila je u posjetu IRB-u 13. travnja 2017. Za vrijeme posjeta raspravljali smo o ostvarenju radnog plana te je Koraljka Husnjak pripremila staničnu kulturu mišjih embrionalnih fibroblasta (engl. MEFs, mouse embryonic fibroblasts) iz embrija s divljim tipom DPP III i embrija miševa iz kojih je izbačen DPP III gen (DPP III knock-out miševi). Navedene stanične linije planiramo koristiti za pokuse u suradnji s Laboratorijem za mitohondrijsku bioenergetiku i dijabetes s IRB-a i suradnicima s Instituta za biokemiju, Tehnološkog Sveučilišta u Grazu, Austrija.