Unakrsna veza DNA-protein (eng. DNA-protein crosslink; DPC) je tip DNA oštećenja koje nastaje kao posljedica ireverzibilne kovalentne veze između DNA i proteina u prisutnosti endogenog ili egzogenog DPC inducirajućeg agensa. Endogeni DPC induceri su nusprodukti staničnog metabolizma poput oksidativnih radikala, aldehida i promjene u DNA strukturi, dok su primjeri egzogenih inducera ultraljubičasto i ionizirajuće zračenje te različiti kemijski agensi. DPC-i su česta DNA oštećenja i predstavljaju fizičku prepreku za sve DNA transakcije: replikaciju, transkripciju, rekombinaciju i popravak. Nemogućnost popravka DPC-ova uzrokuje genomsku nestabilnost i teške posljedice za organizam, uključujući preuranjeno starenje, neurodegenreaciju i pojavu tumora. Unatoč visokoj učestalosti pojave DPC-a, malo se zna o mehanizmu njihova popravka, jer se sve donedavno DPC popravak nije smatrao zasebnim mehanizom popravka DNA. Tijekom 2014. i 2016. god. nekoliko grupa je identificiralo nove stanične enzime, proteaze Wss1 i SPRTN, koje proteolizom DPC-a iniciraju njihov popravak. Otkriće proteolizno-ovisnog popravka DPC-a dovelo je do prepoznavanja DPC popravka kao zasebnog mehanizma popravka DNA oštećenja. Međutim, trenutno nije poznata regulacija cijelog mehanizma, niti je poznato koji drugi faktori sudjeluju u popravku, dok gotovo ništa nije poznato o mehanizmu DPC popravka in vivo. Stoga je glavni cilj predloženog projekta otkriti regulaciju puta popravka DPC-a in vivo koristeći ribu zebricu (Danio rerio) kao istraživački model. Koristit ćemo CRISPR/Cas9 gensku manipulaciju kako bi utišali ili mutirali gen(e) od interesa, a za koji pretpostavljamo da su uključeni u DPC popravak. Uloga pojedinih proteina (i njihovih kombinacija) u popravku DPC-a biti će analizirana nakon izolacije DPC-a iz transgeničnih embrija i odraslih jedinki zebrice. Također ćemo konstruirati GFP reporter test s transgenim ribama koji će omogućiti kvantifikaciju učinkovitosti DPC popravka in vivo.

U ovom istraživačkom projektu namjeravamo značajno unaprijediti naše razumijevanje (eko)toksikološke uloge odabranih SLC i MATE transportnih proteina koristeći metode funkcionalne genomike zebrice (Danio rerio). Pri tome ćemo koristiti zebricu kao dobro etablirani i sve važniji istraživački model u biomedicinskim i okolišnim istraživanjima, najvećim dijelom fokusirat ćemo se na uptake i efluks prijenosnike zebrice koji su nedavno in vitro karakterizirani u našoj grupi, karakterizirat ćemo in vitro i prijenosnike koji nisu evaluirani u prethodnim istraživanjima, te u konačnici probati odrediti fiziološku i/ili obrambenu ulogu odabranih prijenosnika zebrice koristeći CRISPR/Cas9 metode editiranja genoma koje su u potpunosti na raspolaganju u našem laboratoriju. U skladu s tim postavkama ovdje naglašavamo dva ključna argumenta za ovaj projektni prijedlog, koje konzistentno prevodimo u ključne ciljeve projekta:

1)         Polispecifični uptake i efluks transportni proteini djeluju kako integralni dijelovi staničnog obrambenog/detoksikacijskog sustava u sisavaca, te vrlo vjerojatno imaju slične uloge u vodenih kralješnjaka, riba općenito te analogno tome ribe zebrice. Stoga je naša hipoteza da će zebrice deficijentne s obzirom na prisustvo i ekspresiju membranskih prijenosnika od potencijalne (eko)toksikološke važnosti: (a) pokazati detektabilne promjene fenotipa tijekom embrionalnog razvoja i/ili u kasnijim razvojnim stadijima, kao posljedice promjene u transportu fiziološki važnih supstrata predmetnih prijenosnika; ili (b) se značajno razlikovati u osjetljivosti na modelne toksične spojeve u usporedbi s divljim (wild type - WT) zebricama. Stoga, koristeći se kombinacijom novih in vitro saznanja i rezultata in vivo studija s genetski deficijentnim zebricama za istraživane prijenosnike koje ćemo kreirati tijekom projekta, osigurat ćemo nove uvide kritične za razumijevanje njihove (eko)toksikološke relevantnosti;

2)         Pored značajnih sličnosti, raspoloživi podaci jasno ukazuju i na razlike između sisavaca i zebrice u pogledu identiteta relevantnih membranskih prijenosnika, razine njihove ekspresije, supstratnih preferencija i osjetljivosti na inhibitore. Prema tome, u ovom projektu pribavit ćemo temeljna saznanja važna za bolje razumijevanja uloge odabranih SLC prijenosnika te relevantnu interpretaciju pokusnih podataka dobivenih korištenjem zebrice kako važnog istraživačkog modela kralješnjaka.

Marie Curie Initial Training Networks (ITN) project